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微衛(wèi)星不穩(wěn)定那些事兒
瀏覽次數(shù)：4921 發(fā)布時間：2019-11-13
作者：李笑榮
一：什么是微衛(wèi)星不穩(wěn)定
微衛(wèi)星為生物基因組中短核苷酸串聯(lián)重復序列，由于其重復特性，在DNA復制過程中易生錯誤。在正常細胞中DNA錯配修復系統(tǒng)糾正DNA復制過程出現(xiàn)的錯誤，確保復制過程的"保真性"。然而，當DNA錯修（ mismatch repair，MMR）基因(主要是MLH1、PMS2、MSH2、MSH6)發(fā)生胚系突變或體細胞MLH1啟動子過度甲基化導致MMR蛋白表達缺失時，微衛(wèi)星復制錯誤不能被糾正即發(fā)生MSI。
近些年，在我國結直腸癌發(fā)病率呈上升趨勢。其發(fā)生途徑按照分子變化分為（1）以DNA微衛(wèi)星改變?yōu)樘卣鞯奈⑿l(wèi)星不穩(wěn)定型(microsatellite instability，MSI)；（2）以部分或整個染色體為途徑的染色體不穩(wěn)定型(chromosomal instability，CIN)。結直腸癌約15%經(jīng)MSI途徑發(fā)生。其中約12%為散發(fā)性 MSI 結直腸癌，發(fā)生機制為MLH1 基因啟動子發(fā)生甲基化使該基因沉默、發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定性而致的 CRC。此外，由 MLH1、 PMS2、 MSH2、 MSH6 等 MMR 基因發(fā)生胚系突變所致Lynch 綜合征，約占3%。該綜合征是一種常染色體顯性遺傳病。患者除了發(fā)生結直腸癌，還可發(fā)生子宮內(nèi)膜癌、膽管細胞癌等腸外腫瘤。
圖1 MSI途徑發(fā)生的結直腸癌
MSI國際研究合作組織推薦對Bat26、Bat25、D5S346、D2S123和D17S250五個微衛(wèi)星位點進行檢測，根據(jù)微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定的數(shù)量對MSI進行分類。（1）高頻MSI(MSI–H)：具有兩個或兩個以上位點改變；（2）低頻MSI(MSI–L)：僅有一個位點發(fā)生改變；（3）微衛(wèi)星穩(wěn)定型(MSS)：沒有位點發(fā)生改變。通常，由于MSI-L與MSS的臨床表現(xiàn)無明顯差別，所以將MSI-L劃入MSS中。
二：為什么檢測MSI結直腸癌MSI結直腸癌與MSS結直腸癌相比，在預后、治療等方面均存在差異，而且與lynch綜合征密切相關。MSI結直腸癌檢測臨床意義包括以下三個方面。
（1）預后性：臨床研究發(fā)現(xiàn)，在Ⅱ期結直腸癌，MSI狀態(tài)可作為預后的獨立預測因子，
如圖2所示，MSI-H Ⅱ期結直腸癌5年無復發(fā)生存率高于MSS Ⅱ期結直腸癌。即在Ⅱ期結直腸癌患者中，MSI-H狀態(tài)提示良好預后。
圖2 MSI-H Ⅱ期結直腸癌5年無復發(fā)生存率高于MSS Ⅱ期結直腸癌
（2）預測性：指導治療
5-氟尿嘧啶（5-FU）是結直腸癌術后輔助治療的重要化療藥物。Piero Benatti等開展回顧性研究發(fā)現(xiàn)，MSI-H Ⅱ期結直腸癌患者對5-FU治療不敏感。NCCN指南指出MSI-H Ⅱ期結直腸癌患者有良好預后但不能從5-FU治療獲益。
（3）Lynch綜合征的輔助診斷及篩查
Lynch綜合征家族不僅發(fā)生結直腸癌的風險增高，還可以發(fā)生子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌以及膽管細胞癌等腸外腫瘤。從MSI-H結直腸癌中篩選出可疑患者，就個人而言早期診斷和預防性息肉切除術可以降低CRC死亡率。此外，還可以為患者家族成員提供腫瘤預防和篩查。研究表明，阿司匹林能夠預防Lynch綜合征相關腫瘤的發(fā)生。
三: 怎么檢測MSI 微衛(wèi)星不穩(wěn)定？在MSI結直腸癌中，MSI是分子特征，DNA錯配修復基因缺陷是分子特征。因此，目前可用免疫組化檢測DNA錯配修復（MMR）基因相關蛋白的表達，以及基于PCR檢測多個微衛(wèi)星位點。
（1）免疫組化檢測DNA錯配修復蛋白：常規(guī)開展4 種MMR蛋白檢測（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6。錯修復蛋白在正常腸腺上皮細胞以及淋巴細胞、平滑肌細胞、血管內(nèi)皮細胞均表達，可作為內(nèi)對照。對單個錯修復蛋白來說，當內(nèi)對照細胞核陽性而癌細胞全陰性（即沒胞核著色）時，表明該蛋白表達缺失?？傮w上說，當腫瘤細胞出現(xiàn)一個或多個錯修復蛋白缺失時，可判讀為錯配修復基因缺失（ MMR deficient， dMMR），提示腫瘤為MSI-H；當腫瘤細胞無錯修復蛋白缺失，判讀為錯配修復基因無缺失（MMR proficient， pMMR），提示腫瘤為 MSI-L 或 MSS。
圖3 免疫組化檢測結直腸癌DNA錯修復基因（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）表達
（2）PCR檢測多個微衛(wèi)星位點：該方法通過PCR擴增特定的微衛(wèi)星序列（Bethesda指南5個位點），然后通過基因分析儀測序，最終比較正常和腫瘤組織的微衛(wèi)星長度差異。如前所述，然后根據(jù)微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定的數(shù)量，判讀為MSI–H（具有兩個或兩個以上位點改變）、MSI–L（僅有一個位點發(fā)生改變)、MSS（沒有位點發(fā)生改變）。
總體來說，免疫組化和PCR兩種檢測方法的敏感度和特異性均在90 %以上，且文獻報道二者一致率可以達到97.8 %以上。錯修復蛋白免疫組化檢測結果如表1所示，其中最常見的免疫組化表達模式為MLH1-/PMS2-和MSH2-/MSH6-。與PCR方法相比，IHC檢測結果可以揭示缺失的基因種類，有利于下一步基因測序分析或進一步篩查Lynch綜合征。免疫組化由于簡單、經(jīng)濟且更易于在病理科開展推廣。此外，免疫組化對組織樣本量要求不高，穿刺活檢也適用。所以，免疫組化檢測結直腸癌組織MMR可以作為一種初篩的手段。需要注意的是，少數(shù)錯義突變導致錯修復蛋白功能異常，由于保留“抗原性”導致免疫組化檢測出現(xiàn)假陽性。PCR方法則可互補，但由于技術相對復雜、費用較高使得在基層病理科較難推廣。
在正常的組織炎癥反應中，PD-1/PD-L1通路是T細胞免疫反應的負反饋調(diào)節(jié)機制。腫瘤細胞通過高表達PD-L1與活化的T細胞表面PD-1結合，就像給免疫系統(tǒng)“踩剎車”。如果特異性阻斷PD-1和PD-L1的結合即給免疫系統(tǒng)“松剎車”。各大藥廠基于這樣的原理研發(fā)一系列藥物，如以PD-1為藥物靶點的Pembrolizumab(Keytruda)、 Nivolumab(Opdivo)，以PD-L1為靶點的Tecentriq、Durvalumab。且抗PD-1/PD-L1免疫治療在黑色素瘤、非小細胞肺癌、膀胱癌、腎細胞癌等均有較好的治療響應率。
關于抗PD-1/PD-L1免疫治療在結直腸癌中的作用，最初嘗試的臨床實驗結果顯示33例結直腸癌患者僅有1例得到緩解。得到緩解的這位患者與其他有何不同？2015年， Le DT等發(fā)表在New England journal of medicine里程碑式的發(fā)現(xiàn)：抗PD-1藥物Pembrolizumab在錯配修復缺陷(dMMR)的結直腸癌患者中反應率顯著提高。該臨床試驗患者分成3組：A:10位錯修復缺陷(dMMR)結直腸癌患者、B：18位錯修復無缺陷(pMMR)結直腸癌患者、C：7位錯修復缺陷(dMMR)的其他腫瘤（除了結直腸癌）。如表2所示，免疫相關客觀反應率分別為40%、0、70%，免疫相關20周無進展生存率(%)分別為 78%、11%、67%。數(shù)據(jù)顯示不僅dMMR的結直腸癌患者獲益，而且dMMR的非結直腸癌患者，如子宮內(nèi)膜癌、膽管癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌等也可從抗PD-1治療獲益。提示dMMR腫瘤患者均可從抗PD-1治療獲益。6月8日，Dung T. Le等science發(fā)表了《Mismatch-repair deficiency predicts response of solid tumors to PD-1 blockade》，該研究評估了PD-1抗體對12種dMMR腫瘤的治療效果（圖4），進一步證實了抗PD-1免疫治療針對dMMR腫瘤患者的“實力”。
表2 MMR與抗PD-1臨床實驗數(shù)據(jù)
dMMR, CRC （ A ） | pMMR, CRC(B) | dMMR, 非 CRC(C) | |
免疫相關 客觀反應率 (%) | 40 | 0 | 71 |
95%CI | 12-74 | 0-20 | 29-96 |
免疫相關 20 周 無進展生存率 (%) | 78 | 11 | 67 |
95%CI | 40-97 | 1-35 | 22-96 |
中位隨訪時間 ( 周 ) | 36 | 20 | 21 |
圖4 PD-1免疫治療獲益的12種腫瘤類型
至于dMMR患者為什么能從抗PD-1治療獲益的機制并不清楚。文獻報道可能的機制：dMMR結直腸癌更容易被T細胞浸潤。對腫瘤細胞分析發(fā)現(xiàn)dMMR結直腸癌在腫瘤浸潤面、腺癌細胞間和腫瘤間質(zhì)中有更多的CD8+以及輔助T細胞浸潤。此外，dMMR與pMMR相比，突變累積，產(chǎn)生更多“新抗原（Neoantigen）”,更易被免疫系統(tǒng)識別，這也是獲益的可能機制。
《2017 NCCN結直腸癌指南》推薦PD-1免疫治療單抗pembrolizumab和nivolumab可用于dMMR/MSI-H結直腸癌晚期治療。此外，5月23日，F(xiàn)DA批準Keytruda用于所有具有高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H）或者錯配修復缺陷（dMMR）實體瘤患者的治療。這是首次不分腫瘤類型，僅考慮腫瘤標志物治療藥物。從“同病異治”到“異病同治”，具有劃時代的意義。
圖5 PD-1/PD-L1與dMMR
五：腫瘤負荷腫瘤突變負荷（Tumor Mutation Burden,TMB），通常定義為每個癌癥病人外顯子測序每百萬堿基（MB）的非同義突變數(shù)目。文獻資料顯示TMB可能成為腫瘤潛在的生物標記物。美國紀念斯隆-凱特琳癌癥中心的Leonard B. Saltz等報告的一項研究對224例結直腸癌患者通過自定義雜交捕獲進行二代測序，腫瘤突變負荷按照除拷貝數(shù)及結構重排的非同義突變數(shù)目計算，并同時進行免疫組化檢測錯修復基因表達水平。研究發(fā)現(xiàn)193例錯配修復基因正常(pMMR)患者突變數(shù)＜20；突變數(shù)≥20的31例患者中，28例（90%）是錯配修復基因缺陷(dMMR)。剩余的3例因為維護基因組穩(wěn)定的基因PLOE發(fā)生P286R突變，伴有高負荷突變，導致3例pMMR突變數(shù)均＞150，這種情況也很容易被識別。
圖6 結直腸癌中的腫瘤突變負荷情況
如圖6所示，作者將突變負荷設定為≥20且＜150定義為dMMR,，則用基因二代測序預測MMR的狀態(tài)的靈敏度和特異性都是1.0（95%CI，0.93~1.0）。該研究基于dMMR腫瘤中突變累積較多，將MMR狀態(tài)與腫瘤負荷建立對應關系。提示TMB可作為結直腸癌MMR檢測的標志物。
基因科技相關產(chǎn)品（一） 錯修復蛋白（免疫組化法）
名稱 | 貨號 | 克隆號 |
MLH1 | GT2189 | ES205 |
MSH2 | GT2105 | 25D12 |
MSH6 | GT2195 | EP49 |
PMS2 | GT2159 | EP51 |
（二） 焦磷酸測序技術服務
焦磷酸測序以目標DNA的一條單鏈為模板，以測序引物作為引導鏈，通過四種酶的級聯(lián)反應將核苷酸鏈的延伸過程轉(zhuǎn)化成熒光信號。
1 MLH1 甲基化檢測
MLH1 屬于 MMR 家族的錯配修復基因，是細菌錯配修復基因 mutL 的同源物。該基因定位于 3p21，其基本功能是與其它的 MMR 蛋白相互作用形成一種多聚復合物，消除 DNA 復制過程中由于 DNA 聚合酶滑移而引起的堿基錯配、插入以及缺失的形成。MHL1 基因啟動子區(qū)的甲基化與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。
在結直腸癌中，15%經(jīng)MSI途徑發(fā)生。其中約12%為散發(fā)性 MSI 結直腸癌，發(fā)生機制為MLH1 基因啟動子發(fā)生甲基化使該基因沉默、發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定性而致的 CRC。此外，由 MLH1、 PMS2、 MSH2、 MSH6 等 MMR 基因發(fā)生胚系突變所致Lynch 綜合征，約占3%。如圖7所示，lynch綜合征與散發(fā)性MSI結直腸癌的鑒別篩查過程中,MLH1啟動子甲基化檢測在篩查中起重要作用。
圖7：lynch綜合征與散發(fā)性MSI結直腸癌的鑒別篩查過程
2 B-raf 基因突變檢測
B-raf 是一種癌基因，它編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 通路重要的轉(zhuǎn)導因子，參與調(diào)控細胞內(nèi)多種生物學事件，如細胞生長、分化和凋亡等。研究表明，在多種人類惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤、結直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的 B-raf 基因突變，約 66% 惡性黑色素瘤和15％的結腸癌中 B-raf 基因存在體細胞錯義突變。大約 80-90% 的 B-raf 基因突變發(fā)生在 exon15的 1799 核苷酸上，T 突變?yōu)?A，導致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代 (V600E)。目前認為，V600E 突變可模擬 T599 和 S602 兩個位點的磷酸化過程，從而使 B-raf 蛋白異常激活。
在結直腸癌中，散發(fā)性的MSI結直腸癌約有63.5%存在B-raf V600E突變，但lynch綜合征中基本無B-raf V600E突變。如圖7所示，B-raf V600E突變可以用于lynch綜合征與散發(fā)性MSI結直腸癌的鑒別診斷。
此外，2013 年 4 月出版的美國醫(yī)學協(xié)會雜志（journal of american medical association，JAMA）報道了 BrafV600E 對甲狀腺人乳頭瘤（Papillary Thyroid Cancer, PTC）預后的影響。文章指出 BrafV600E 突變極大的影響了 PTC 病人的存活率等一系列預后指標。B-raf 突變狀態(tài)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及臨床結局有關。隨著 B-raf 突變研究的深入，可望為闡明腫瘤發(fā)生的分子機制，尋找新的治療途徑與靶點提供思路。
參考文獻：
參考文獻太多，此處不一一列舉。
